Fraccionamento/Separação
Celular
Células Sanguíneas
Macrofagos
Monócitos
Neutrófilos
PMN
Eosinófilos
Basófilos
Linfócitos
T
B
NK
CD4
CD8
Células do Sistema Imune
- Eritrocitos (RBC)
- Células sem núcleo ou outros organelos
- Sobrevivem em circulação ate 120 dias
- Constituídos por hemoglobina (90%) e de forma bicôncava
- Plaquetas (platelets)
- Células homeostáticas para a coagulação sanguínea, responsáveis pelalibertação de substancias vaso constritoras
- Polimorfonucleados = Eosinofilos + basofilos + neutrofilos
- Formam-se na medula óssea
- têm uma vida de 3 a 4 h após a qual se fixam nos tecidos
- São atraídos para tecidos inflamados/infectados por factores quimiostáticos.Matam envolvendo o agente infeccioso e libertando os grânuloscitoplasmáticos (mieloperoxidase)
- Importância destacada nas reacções alérgicas agudas e crónicas
- Macrofago
- Célula fagocitaria derivada do monocito
- Exerce funções no sistema imunitário inato e adquirido
- Estão presentes nos pulmões, baço, fígado, e nódulos linfáticos onde,grosso modo, combatem bactérias, vírus, e protozoários intracelulares.
- NK - células natural killer
- Sao linfócitos largos e granulares que não expressam IG oureceptores T mas são capazes de reconhecer e destruir célulastumorais ou infectadas por vírus.
Linfocitos
-Células especializadas no reconhecimento dos antigénios
- Dividem se em dois tipos:
- Células B – desenvolvem-se na medula óssea ediferenciam se em células produtoras de anticorpos, imunoglobulinas (IG) -imunidade humoral
- Células T - diferenciam-se no timo e nas suas funçõesincluem apoiar células B na produção de IG e actividade microbicida querpor contacto celular directo ou pela libertação de citoquinas - imunidadecelular
• CD4 células helper (Th)
• CD8 citotóxicas (Tc)
Separação de células sanguíneas
•Centrifugação
•Panning
•Separação imunomagnética
•Cromatografia de afinidade
•Citometria de fluxo
•FACS (fluorescence-activated cell sorter)
Centrifugação
A suspensão de células vai ter partículas com diferentes- tamanho - carga - densidade
Separação pela aplicação de força centrifuga elevada(600 mil x g)
Aplicações:
• técnica preparativa paraseparar um dadocomponente para estudo
• técnica analítica paradeterminar propriedades físicas(pm; densidade, forma) oupesquisar a presença de macromoléculas
Centrifugação Diferencial
Envolve a separação do material solúvel entre omaterial celular insolúvel
A força centrífuga e o tempo de centrifugação sãoajustadas de forma a assegurar que o material insolúvelfica no pellet e o material solúvel (proteínas) fica nosobrenadante Ex: sangue/plasma
Centrifugação em Gradiente
Envolve a separação de partículas com base na suamassa e forma mas numa solução de densidade (desacarose) e/ou de concentração (de sais) crescente
A amostra é colocada no cimo do tubo e durante acentrifugação migram de acordo com a sua velocidade desedimentação
Separação de linfócitos em gradientede densidade
Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas maisdensas, que por sua vez impedem as menos densas desedimentar
•EX: centrifugação de gradiente de Ficoll-Hypaque
Ficol: polisacarideo
–Agrega eritrócitos tornando-os mais densos
Metrizamida (composto denso contendo iodo)
–Densidade ajustável em função da concentração
density
Ficoll-hypaque
Células
mononucleares
Soro
plaquetas
Eritrócitos + leucócitos polimorfonucleares (granulócitos) –mais densos
Células mononucleares (linfócitos + monócitos) – menosdensos - recuperados à superfície
PANNING
•Aderência celular a uma superfície sólida
–Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes
(medula óssea)
–Outras células podem aderir se a superfície estiverconjugada com anticorpos apropriados
(anti IG- separam B de T)
Separação Imunomagnética
• forma rápida de separação de grandesquantidades de linfócitos
• acoplamento de esferas magnéticas aanticorpos monoclonais que reconhecemmoléculas da superfície das células
• os anticorpos acoplados às esferasmagnéticas, são misturados com ascélulas a separar. A mistura passa poruma coluna magnética, que reterá ascélulas ligadas ao anticorpo
Separação Imunomagnética
Cromatografia
Princípio:
As moléculas dissolvidas numa solução podem associar-se oudissociar-se de uma superfície sólida. Se a solução semantiver em fluxo as moléculas podem-se separar de acordocom as interacções com o suporte
Em coluna
Cromatografia de afinidade
Baseada na capacidade de uma proteína/componente seligar especificamente a outra partícula (anticorpo)
• As colunas contêm esferas ligadas covalentemente aanticorpos específicos da proteína de interesse –coluna de imunoafinidade
• As partículas são depois eluídas por ex. por umasolução concentrada de ligando, pH diferente do deligação.
FACS
Fluorescence-activated cell sorter
• Permite separar subpopulações delinfócitos com base nas dierentesproteínas expressas á superfície (B,TCD4, TCD8)
• Cada tipo celular é marcado comum anticorpo específico que seencontra acoplado a um corantefluorescente.
• O citómetro de fluxo detecta econta individualmente as célulasque passam através do laser
Purificação positiva e negativa
•Purificação Positiva (as células são separadas por apresentaremuma dada característica)
•Purificação Negativa
–Panning
–Imuno-separação magnética
–Centrifugação gradiente densidade
–Formação de rosetas (Linf T/B)
–Citometria de Fluxo
–Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento (Linf TCD4/CD8)
–RIA (Radioimmunoassay)
–ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Preservação
•Tecidos (sangue, medula ossea, outros tecidos linfoides)
- Criopreservação - 80 ºC (3 meses; perda progressivadas características)
•Células (culturas celulares, células previamente separadas)
- Crioprotecção - 40 ºC (semanas)
- 80 ºC (anos)
–No caso dos linfócitos ocorrem sempre algumasalterações ao nível das moléculas de superfície(fenotipagem antes da utilização)